Cách thức Đánh giá acid amin là bí quyết xác định thành phần và hàm lượng các acid amin trong các protein và peptid, cũng như trong các chế phẩm thuốc. Bí quyết Tìm hiểu acid amin được vận dụng để định tính và định lượng các protein và peptid dựa trên những cấu tử acid amin tạo ra chúng , để giúp việc xác định cấu trúc của những protein và peptid cũng như việc xác định phương pháp phân đoạn của chúng nhằm thiết lập giản đồ peptid và để phát hiện những acid amin ko tiêu biểu mang thể mang mặt trong 1 protein hoặc peptid. Trước khi Nhận định Axit amin tổng hợp trong protein hoặc peptid, cần yếu phải thủy phân protein hoặc peptid thành các acid amin. Sau Đó tiến hành phân tích những acid amin thu được giống như lúc ta phân tích các acid amin tự do với trong các chế phẩm thuốc. Điều quan trọng là chúng phải được biến đổi thành các dẫn chất phù hợp cho việc phân tách và phát hiện. Đồ vật những bí quyết để Tìm hiểu acid amin thường dựa trên việc tách các acid amin mang trong mẫu thử bằng phương pháp sắc ký. Các vật dụng sắc ký tự động thường chiếm lợi thế. Thiết bị Tìm hiểu acid amin điển hình là 1 máy sắc ký lỏng áp suất rẻ hoặc áp suất cao, mang khả năng thực hiện chương trình dung môi để tách những acid amin khi qua cột sắc ký. Máy cần sở hữu thêm đồ vật điều chế dẫn chất acid amin sau cột. Để phát hiện kết quả, thường dùng detector hấp thụ tử ngoại - khả kiến hoặc detector huỳnh quang đãng, tùy thuộc vào cách điều chế dẫn chất đã áp dụng. Một trang bị tích phân cho phép chuyển đổi dấu hiệu tương tự đi từ detector ra và cho phép định lượng. Các máy chuyên dùng để Đánh giá acid amin thường được ưa sử dụng. Chú ý Nhiễu các con phố nền luôn là mối để ý của người tiến hành Đánh giá acid amin. Để giải quyết, phải dùng các thuốc thử có độ trong sáng cao (thí dụ acid hydrocloric mang độ tinh khiết rẻ với thể gây nhiễm glycin). Thường ngày bí quyết một đôi tuần lại phải thay mới những thuốc thử. Chỉ dùng những dung môi dùng cho sắc ký lỏng cao áp. Lọc lại các dung môi trước khi sử dụng để tránh sự nhiễm khuẩn và những tạp chất. Đậy kín những bình cất dung môi. Ko để những trang bị Phân tích acid amin tiếp xúc trực tiếp mang tia sáng mặt trời. Chất lượng thực hành phòng thử nghiệm có thể quyết định chất lượng Đánh giá acid amin. Giữ phòng thí nghiệm sạch sẽ. Đặt thiết bị Phân tích trong phòng thể nghiệm tại chỗ riêng biệt, ít bị tác động của các hoạt động khác. Định kỳ rửa sạch và chuẩn hóa lại những pipet. Bảo quản đầu pipet trong hộp đậy kín. Không được cầm đầu piped bằng tay è cổ, phải với bít tất tay bằng cao su không thoa bột talc hoặc có chất lượng tương đương. Hạn chế số lần mở và đóng bình cất loại thử vì bụi mang thể khiến gia t ăng kết quả về hàm lượng những chất glycin, serin và alanin. Cần bảo dưỡng rẻ thiết bị Nhận định acid amin để sở hữu kết quả chấp thuận được. Ví như trang bị được sử dụng bình thường thì hàng ngày phải kiểm tra độ rò rỉ dung môi của thiết bị, độ ổn định của đèn và detector, độ phân giải của cột. Định kỳ khiến sạch hoặc thay thế các kính lọc của thiết bị và các linh phụ kiện cần bảo dưỡng khác. Những chất đối chiếu Trên thị trường sở hữu sẵn những acid amin chuẩn để dùng trong Tìm hiểu acid amin; chúng thường là hỗn tạp những acid amin chuẩn trong nước. Khi cần xác định thành phần acid amin trong 1 dòng thử, những protein hoặc peptid chuẩn phải được Phân tích đồng thời có dòng thử để kiểm tra sự vẹn tuyền của thí điểm. Trong trường hợp này, chuẩn protein được tiêu dùng là albumin huyết thanh bò thuần khiết cao. Chuẩn hóa trang bị Việc chuẩn hóa trang bị Tìm hiểu acid amin được thực hiện bằng bí quyết Phân tích một chuẩn acid amin, gồm hẩu lốn những acid amin chuẩn đã biết trước hàm lượng của từng chất, để xác định hệ số đáp ứng và khoảng tuyến tính ứng với mỗi một acid amin chuẩn đã thử. Hai Pha loãng dòng chuẩn acid amin thành phổ thông dung dịch mang nồng độ khác nhau, nằm trong khoảng tuyến tính dự đoán trước của những acid amin có trong loại chuẩn. Tiến hành Đánh giá đa dạng lần có mỗi nồng độ. Mô tả kết quả thu được trên biểu đồ thể hiện tương quan giữa diện tích pic thu được ứng với mỗi nồng độ của acid amin đã thử. Nhờ biểu đồ này, có thể xác định được khoảng tuyến tính của mỗi acid amin, tại chậm triển khai, các diện tích pic thu được có tương quan xấp xỉ tuyến tính sở hữu những nồng độ của những acid amin đã thử. Lúc Tìm hiểu acid amin, để mang kết quả đúng và lặp lại, điều quan yếu là phải pha và thí điểm trên những cái thử mang nồ ng độ nằm trong khoảng tuyến tính tương ứng có khoa học Đánh giá đang vận dụng. Để xác định hệ số đáp ứng cho mỗi acid amin, ta Nhận định 4 - 6 nồng độ của EDTA Cu chuẩn tương ứng. Hệ số đáp ứng tính được là giá trị nhàng nhàng của diện tích pic (hoặc của chiều cao pic) ứng với nồng độ 1 nanomol của dung dịch acid amin chuẩn. Thiết lập một dãy chuẩn hóa bao gồm hệ số đáp ứng tương ứng của các acid amin và dùng dãy này để tính nồng độ (nanomol) của mỗi acid amin có trong loại thử bằng bí quyết chia diện tích pic (hoặc chiều cao pic) thu được của acid amin chậm tiến độ cho hệ số đáp ứng tương ứng có trong dãy chuẩn hóa. Trong việc Đánh giá thường nhật, khi sử dụng dãy chuẩn hóa, ta chỉ cần xác định một diện tích pic là đủ. Không những thế, dãy chuẩn hóa này phải th ường xuyên được thử lại bằng những Đánh giá rà soát và được cập nhật để bảo đảm tính kiêm toàn của nó. Chất chuẩn nội tuyệt vời là một acid amin bậc nhất nhân tạo, mang sẵn trên thị tr ường sở hữu giá tốt. Chất này phải vững bền trong thời kỳ thủy phân, với hệ số đáp ứng tuyến tính sở hữu nồng độ và phải được rửa giải cho một pic mang thời kì lưu độc nhất vô nhị và được phân giải thấp mang những pic tương ứng mang các acid amin khác. Các chuẩn nội thường được sử dụng bao gồm norleucin, nitrotyrosin và acid α -aminobutyric. Thủy phân protein thiết yếu phải tiến hành thủy phân những dòng thử protein và peptid trước khi Đánh giá các acid amin tạo thành. Để hạn chế sai kết quả, những đồ thủy tinh dùng trong thủy phân phải khôn xiết sạch. Dấu vân tay trên ống thủy phân hoặc bột tách ra trong khoảng bít tất tay cũng mang thể khiến nhiễm bẩn mẫu thử. Để rửa sạch những ống thủy tinh dùng trong thủy phân (ống thủy phân), ta đun sôi chúng 1 giờ trong acid hydrocloric một M hoặc ngâm chúng trong acid nitric đậm đặc hoặc trong hỗn hợp đồng thể tích acid hydrocloric và nitric đậm đặc. Sau ngừng thi côngĐây tráng sạch bằng nước đựng tinh khiết cao, tiếp tới bằng methanol sử dụng trong sắc ký lỏng cao thế. Cuối cùng sấy qua đêm trong tủ sấy rồi bảo quản kín cho đến khi sử dụng. Cũng có thể nung đồ thủy tinh sử dụng để thủy phân ở nhiệt độ 500 °C trong 4 giờ để giảm thiểu nhiễm bẩn. Cũng có thể tiêu dùng cái dụng cụ phù hợp, chỉ tiêu dùng 1 lần rồi bỏ. Thủy phân bằng acid là phương pháp thông dụng nhất để thủy phân 1 cái thử protein trước lúc tiến hành phân tách những acid amin tạo ra dòng thử chậm triển khai. Thủy phân bằng acid có thể cho kết quả Nhận định đổi thay vì một số acid amin bị phân hủy 1 phần hay hoàn toàn. Cụ thể là: Tryptophan bị phân hủy, serin và threonin bị phân hủy 1 phần, methionin mang thể bị oxy hóa còn cystein thì chuyển đổi thành cystin (tuy nhiên lượng cystin tìm thấy được thường tốt hơn thực tại vì một phần bị phân hủy hoặc bị khử trở lại thành cystein). Có thể tránh sự phân hủy do bị oxy hóa bằng cách thức tiến hành thủy phân trong môi trường chân không phù hợp (áp suất thấp hơn 200 µm thủy ngân hoặc 26,7 Pa) hoặc bằng phương pháp nạp một khí hiếm (argon) vào khoảng trống phía trên của bình bức xúc. Những tuyến phố nối peptid giữa isoleucin - isoleucin, valin - valin, isoleucin - valin và valin - isoleucin chỉ với một phần được cắt đứt để phóng thích acid amin thôi. Aspar agin và glutamin đều bị khử amid để thành acid aspartic và acid glutamic tương ứng. Vì tryptophan, asparagin và glutamin bị mất mát khi mà thủy phân bằng acid nên ta chỉ còn định lượng được 17 acid amin. Một số công nghệ thủy phân biểu đạt sau đây sẽ nói cách thức giải quyết những chướng ngại nêu trên. Ngoài ra một số kỹ thuật (từ số 4 đến số 11) lại mang thể biến đổi 1 số acid amin khác. Bởi vậy cần cân đề cập lợi hại khi chọn kỹ thuật thủy phân protein/peptid và phải thực nghiệm phù hợp trước lúc chọn một công nghệ thủy phân khác khoa học thủy phân bằng acid. Thường hay dùng cách Tìm hiểu acid amin theo chương trình thời gian thủy phân (tức là Phân tích acid amin ở những thời khắc thủy phân là 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ) để xác định nồng độ ban sơ của các acid amin dễ bị phân huỷ hoặc chậm bị phân tách lúc thủy phân: Vẽ đồ thị biểu thị sự can hệ giữa nồng độ thu được của acid amin dễ bị phân hủy (thí dụ serin, threonin) mang thời kì thủy phân rồi ngoại suy tới điểm gốc thời gian, ta sẽ được nồng độ ban đầu (nồng độ ở gốc thời kì ) của acid amin dễ bị phân hủy chậm triển khai. Áp dụng cách thức chương trình thời kì thủy phân này cho các acid amin chậm được phân tích (ví dụ isoleucin và valin), trên đồ thị sẽ có một đoạn bằng (đoạn thẳng nằm ngang) ứng mang nồng độ của acid amin cần Nhận định chậm tiến độ. Giả dụ thời kì thủy phân quá dài, nồng độ của các acid amin cần Nhận định sẽ bắt đầu giảm, chứng tỏ acid amin ngừng thi côngĐây đã bị phân hủy do điều kiện thủy phân. 1 bí quyết khác của Phân tích acid amin theo chương trình thời kì thủy phân được chấp nhận là cho 1 chuẩn acid amin trải qua cộng những điều kiện như lúc thủy phân chiếc thử protein/peptid. Acid amin chuẩn, ở thể tự do, với thể sẽ không mang kết quả hoàn toàn điển hình cho tốc độ phân hủy của các acid amin dễ bị phân hủy có trong chiếc thử protein/peptid. Điều này đặc trưng đúng đối mang những kết liên peptid chậm bị phân tích (như kết liên isoleucin - valin). Ngoài ra cách Nhận định này sẽ cho phép giải thích một vài tr ường hợp phân hủy acid amin trong mẫu thử. 4 phương pháp thủy phân bằng acid trong lò vi sóng cũng đã được dùng, cho kết quả mau chóng nhưng đòi hỏi vật dụng đặc trưng và cần thận trọng đặc thù. Phải xác định được những điều kiện thủy phân trong lò vi sóng tối ưu cho mỗi dòng thử protein/peptit riêng biệt. Thủy phân trong lò vi sóng chỉ cần thời kì ít phút, nhưng nếu chỉ thêm hoặc bớt một phút so có yêu cầu thôi cũng sẽ sở hữu thể mang kết quả lệch lạc (hoặc do những acid amin dễ bị phân hủy sẽ bị phân hủy hoặc do dòng thử chưa được thủy phân hoàn toàn). Bí quyết thủy phân hoàn toàn bằng 1 hẩu lốn những men protease cũng được ứng dụng nhưng phức tạp, đòi hỏi phải được kiểm soát chặt chẽ và thường được áp dụng phổ thông để Đánh giá những peptid hơn là các protein. Lúc tiến hành Nhận định lần đầu một chiếc thử protein mới, cần phải khiến thực nghiệm để xác định những điều kiện tối ưu về thời gian và nhiệ độ thủy phân. Công nghệ thủy phân một Thủy phân bằng acid hydrocloric có cất 1 lượng phenol là khoa học thông dụng nhất để thủy phân loại thử protein/peptid trước khi tiến hành Nhận định acid amin. Thêm phenol vào môi trường thủy phân cốt để ngăn đề phòng hiện tượng halogen hóa tyrosin. Dung dịch thủy phân: Acid hydrocloric 6 M cất trong khoảng 0,1% đến 1% phenol. Thủy phân pha lỏng: Cho vào ống thủy phân chiếc thử protein/peptid rồi làm khô (để cái nước, hạn chế pha loãng dung dịch thủy phân). Cứ 500 µg dòng thử đông khô, ta thêm 200 µl dung dịch thủy phân. Làm lạnh ống thử trong aceton đông băng khan. Hàn ống thủy phân ở chân không. Thủy phân dòng thử trong 24 giờ ở 110 °C và trong chân ko hoặc khí trơ để tránh oxy hóa. Nếu như lo ngại mẫu thử chưa được thủy phân hoàn toàn, cần nghiên cứu kéo dài thêm thời gian thủy phân (thí dụ trong 48 giờ và 72 giờ). Thủy phân pha hơi: Đây là 1 trong các kỹ thuật thủy phân thông dụng nhất được ưa dùng để khiến cho vi Phân tích, lúc chỉ sở hữu 1 lượng nhỏ dòng thử. Công nghệ này cũng cho phép tránh việc mẫu thử bị nhiễm bẩn bởi dung dịch thủy phân. Đặt ống thủy phân đựng mẫu thử đã làm khô trong một ống nghiệm lớn hơn, ống này chứa 1 lượng thích hợp dung dịch thủy phân và tương tự ngăn không cho cái thử tiếp xúc trực tiếp mang dung dịch thủy phân. Hút chân ko (áp suất rẻ hơn 200 µm thủy ngân hoặc 26,7 Pa), hoặc bơm 1 khí trơ vào phần trên của ống nghiệm. Hàn ống lớn và thủy phân ở 110 ºC trong 24 giờ. Tương đối acid sẽ thủy phân chiếc thử và lượng acid ngưng tụ trong ống thủy phân chứa dòng thử là tối thiểu. Sau khi thủy phân xong, sấy khô loại thử trong chân ko để chiếc bỏ acid dôi thừa. Kỹ thuật thủy phân hai Giảm hiện tượng oxy hóa tryptophan trong khi thủy phân bằng cách thức tiêu dùng acid mercaptoethansulfonic (MESA) khiến acid khử. Dung dịch thủy phân: Dung dịch MESA 2,5 M Thủy phân pha hơi: làm cho khô một - 100 µg dòng thử protein/peptid trong ống thủy phân. Đặt ống thủy phân trong 1 ống to hơn, chứa khoảng 200 µl dung dịch thủy phân. Hàn ống to trong chân không (áp suất khoảng 50 µm thủy ngân hoặc 6,7 Pa). Thủy phân ở 170 - 185 °C từ 12,5 phút. Sau lúc thủy phân xong khiến cho khô ống thủy phân ở chân ko trong 15 phút để loại acid dư thừa. Kỹ thuật thủy phân 3 Ngăn phòng ngừa hiện tượng oxy hóa tryptophan bằng sử dụng acid thioglycolic (TGA) làm acid khử. Dung dịch thủy phân: Dung dịch acid hydrocloric 7 M đựng 1% , 10% acid trifluoroacetic và 20% acid thioglycolic. Thủy phân pha hơi: làm cho khô trong khoảng 10 tới 50 µg chiếc thử protein/peptid trong một ống thủy phân. Đặt ống thủy phân trong một ống to hơn, chứa khoảng 200 µl dung dịch thủy phân. Hàn ống to trong chân không (áp suất khoảng 50 µm thủy ngân hoặc 6,7 Pa). Thủy phân cái thử ở 166 ºC trong khoảng 15 - 30 phút. Sau lúc thủy phân xong, làm cho khô ống thủy phân trong chân ko trong 5 phút để cái acid dôi thừa. Lượng tryptophan mua thấy sở hữu thể phụ thuộc vào l ượng dòng lấy thử. Khoa học thủy phân 4 Oxy hóa cystein/cystin và methionin bằng acid performic trước khi thủy phân loại thử. 5 Dung dịch oxy hóa: dùng acid performic mới pha bằng bí quyết trộn đều 1 thể tích hydrogen peroxyd 30% (TT) có 9 thể tích acid formic khan (TT), rồi để ở nhiệt độ phòng trong một giờ. Tiến hành: Hòa tan loại thử protein/peptid trong 20 µl acid formic khan (TT) và để ở 50 ºC trong 5 phút. Sau Đó thêm 100 µl dung dịch oxy hóa. Để bức xúc xảy ra trong 10 - 30 phút. Cystein sẽ chuyển thành acid cysteic, còn methionin thành methionin sulfon. Ly tâm chân ko để cái thuốc thử thừa, rồi thủy phân cái thử đã được oxy hóa theo khoa học 1 hoặc 2 đề cập trên. Khoa học 4 này với thể khiến cho biến đổi tyrosin khi môi trường sở hữu muối halid. Khoa học thủy phân 5 Oxy hóa cystein/cystin trong quá trình thủy phân pha lỏng bằng natri azid. Dung dịch thủy phân: Thêm vào dung dịch acid hydrocloric 6 M với cất 0,2% phenol một lượng natri azid (TT) để sở hữu nồng độ 0,2%. Phenol sở hữu trong dung dịch thủy phân ngăn phòng ngừa sự halogen hóa của tyrosin. Thủy phân pha lỏng: Thủy phân mẫu thử protein/peptid ở 110 ºC trong 24 giờ. Trong giai đoạn thủy phân, cystein/cystin trong loại thử chuyển thành acid cysteic bởi tác dụng của natri azid sở hữu trong dung dịch thủy phân. Kỹ thuật 5 này cho kết quả mua thấ y của tyrosin tốt hơn công nghệ 4 nhưng lại ko định lượng được methionin. Methionin chuyển thành hỗn hợp của methionin sở hữu 2 dẫn chất oxy hóa là methionin sulfoxid và methionin sulfon. Công nghệ thủy phân 6 Oxy hóa cystein/cystin bằng dimethyl sulfoxid (DMSO) (TT) Dung dịch thủy phân: Thêm vào dung dịch acid hydrocloric 6 M (TT), đựng 0,1% đến 1% phenol, 1 lượng DMSO để được dung dịch nồng độ DMSO 2% (tt/tt). Thủy phân pha hơi: Tiến hành thủy phân chiếc thử protein/peptid ở khoảng 110 °C trong 24 giờ. Trong quá trình thủy phân, cystein/cystin với trong chiếc thử sẽ bị DMSO với trong dung dịch thủy phân chuyển thành acid cysteic. Để hạn chế sự bất ổn định của kết quả thu được và để chỉnh lý các sai lệch do sự thủy huỷ từng phần, người ta khuyên nên xác định kết quả tìm thấy acid cysteic sau lúc đã thủy phân oxy hóa các chiếc protein chuẩn cất từ một tới 8 mol cystein. Các hệ số đáp ứng thu được từ những dung dịch thủy phân protein/peptid thường thấp hơn khoảng 30% so mang hệ số đáp ứng thu được trong khoảng những chuẩn acid cysteic không qua thủy phân. Vì histidin, methionin, tyrosin và tryptophan đều bị biến đổi nên kỹ thuật 6 này ko cho kết quả Nhận định phần nhiều thành phần cấu tạo của protein/pepti d. Công nghệ thủy phân 7 Khử oxy và alkyl hóa cystein/cystin bằng phản ứng pyridylethyl hóa ở pha h ơi. Dung dịch khử: Cho vào 1 bình thích hợp: 83,3 µl pyridin, 16,7 µl 4-vinylpyridin, 16,7 µl tributyl phosphin và 83,3 µl nước cất rồi trộn đều. Tiến hành: Cho vào ống thủy phân một lượng chiếc thử protein/peptid (trong khoảng trong khoảng một - 100 µg). Đặt ống thủy phân vào một ống to hơn đã có sẵn dung dịch khử. Hàn kín ống lớn ở chân ko (áp suất khoảng 50 µm thủy ngân hoặc 6,7 Pa) rồi khiến cho nóng ở 100 °C trong 5 phút . Sau ngừng thi côngĐây lấy ống thủy phân ra, khiến khô trong bình hút ẩm chân ko trong 15 phút để loại bỏ thuốc thử dư thừa. Chung cục thủy phân dòng thử đã được pyridylethyl hóa, theo một trong những khoa học thủy phân mô tả ở trên. Cùng lúc, tiến hành pyridylethyl hóa trong cộng điều kiện 1 chiếc chuẩn protein chứa 1 - 8 mol cystein để xác định giá trị tìm thấy của pyridylethyl cystein. Chú ý: Việc kéo dài thời gian giận dữ pyridylethyl hóa sẽ gây biến đổi những đội ngũ α-amino và ε – amino của lysin mang trong cái thử protein/peptid. Khoa học thủy phân 8 Khử oxy và alkyl hóa cystein/cystin bằng bức xúc pyridylethyl hóa ở pha lỏng. Những dung dịch gốc: Pha chế và lọc 3 dung dịch trong nước sau đây: Dung dịch gốc A: Dung dịch Tris-hydroclorid 1 M (pH 8,5) cất 4 mM dinatri edetat. Dung dịch gốc B: Dung dịch guanidin hydroclorid 8 M Dung dịch gốc C: Dung dịch 2-mercaptoethanol 10% 6 Dung dịch khử: Pha hỗn tạp gồm một thể tích dung dịch gốc A và 3 thể tích dung dịch gốc B để với dung dịch đệm guanidin hydroclorid 6 M trong Tris-hydroclorid 0,25 M. Tiến hành: Hòa tan khoảng 10 µg cái thử protein/peptid trong 50 µl dung dịch khử, rồi thêm hai,5 µl dung dịch gốc C. Để hai giờ ở nhiệt độ phòng, trong khí nitơ hoặc argon và ở chỗ tối. Để thực hiện bức xúc pyridylethyl hóa, thêm vào khoảng 2 µl 4 -vinylpyridin và để yên ổn hai giờ trong tối, ở nhiệt độ phòng. Sau ngừng thi côngĐây, dòng tạp bằng cách tách bằng sắc ký lỏng cao áp pha đảo. Làm khô mẫu thử protein/peptid sau khi qua sắc ký bằng ly tâm chân ko rồi tiến hành thủy phân bằng acid. Khoa học thủy phân 9 Khử oxy và alkyl hóa cystein/cystin bằng bức xúc carboxymethyl hóa ở pha lỏng. Những dung dịch gốc: Pha như ở kỹ thuật thủy phân 8. Dung dịch carboxymethyl hóa: Dung dịch iodoacetamid 10% trong ethanol 96%. Dung dịch đệm: sử dụng dung dịch khử của công nghệ thủy phân 8. Tiến hành: Hòa tan chiếc thử protein/peptid trong 50 µl dung dịch đệm, thêm khoảng hai,5 µl dung dịch gốc C. Bảo quản 2 giờ trong khí nitơ hoặc argon ở nhiệt độ phòng và trong tối. Thêm một l ượng dung dịch carboxymethyl hóa gấp 1,5 lần tổng lượng các thiol sở hữu trong cái thử theo lý thuyết. Nếu như không biết hàm lượng các thiol trong loại thử thì cứ 20 nanomol protein dùng 5 µl dung dịch iodoacetamid 100 mM. Để tiếp 30 phút trong tối ở nhiệt độ phòng. Sau Đó thêm lượng dư 2-mercaptoethanol để ngừng phản ứng. Loại tạp và thu phần protein/peptid bằng bí quyết phân tách trên sắc ký lỏng pha đảo. Làm cho khô phần protein/peptid thu được bằng ly tâm chân không trước khi thủy phân bằng acid. Trong thời kỳ thủy phân, chất S-carboxyamidomethylcystein đã được chuyển đổi thành S- carboxymethylcystein. Kỹ thuật thủy phân 10 Cystein/cystin tác dụng mang acid dithiodiglycolic hoặc acid dithiodipropionic để cho một disulfid hỗn hợp.Tùy theo yêu cầu về độ phân giải của kỹ thuật Phân tích acid amin được ứng dụng mà chọn tiêu dùng acid dithiodiglycolic hoặc acid dithiodipropionic. Dung dịch khử: Dung dịch acid dithiodiglycolic (hoặc acid dithiodipropionic) 1% trong dung dịch NaOH 0,2M. Tiến hành: Cho vào ống thủy phân khoảng 20 µg loại thử protein/peptid. Thêm 5 µl dung dịch khử và 10 µl isopropanol. Ly tâm chân ko để cái pha lỏng rồi thủy phân dòng thử theo kỹ thuật thủy phân một. Khoa học 10 này với lợi là những thành phần acid amin khác trong dòng thử ko bị ảnh h ưởng của giận dữ và không cần chiếc tạp trước lúc thủy phân. Kỹ thuật thủy phân 11 Trong thời kỳ thủy phân bằng acid, asparagin và glutamin được chuyển đổi thành acid aspartic và acid glutamic tương ứng. Asparagin và acid aspartic được biểu thị bằng 1 đại lượng chung Asx, còn glutamin và acid glutamic bằng Glx. Ngược lại, lúc thủy phân bằng acid với sự mang mặt của thuốc thử bis (1,1-trifluoroacetoxy) iodobenzen (BTI), asparagin và glutamin bị tác dụng và chuyển tương ứng thành acid diamiopropionic và acid diaminobutyric. Nhờ chậm triển khai, ta xác định được asparagin và glutamin trong protein/peptid ngay khi với mặt của acid aspartic và acid glutamic. Các dung dịch khử: Pha chế và lọc 3 dung dịch sau: Dung dịch A: Dung dịch acid trifluoroacetic 10 mM. Dung dịch B: Dung dịch cất guanidin hydroclorid 5 M và acid trifluoroacetic 10 mM. Dung dịch C: Dung dịch mới pha BTI 3,6% trong dimethylformamid. Tiến hành: Cho vào một ống thủy phân sạch khoảng 200 µg chiếc thử protein/peptid, 2 ml dung dịch A hoặc dung dịch B và hai ml dung dịch C. Hàn ống thủy phân trong chân không. Để 4 giờ ở nhiệt độ 60 ºC trong tối. Sau chậm triển khai thẩm tách cái thử bằng nước đựng để loại bỏ thuốc thử dôi thừa. Chiết dòng thử đã thẩm tách 3 lần bằng 3 thể tích tương đương butyl acetat, rồi làm cho đông khô. Rốt cục thủy phân loại thử đông khô theo những khoa học thủy phân đã nói ở trên. Những acid α,b-diaminopropionic và α,g- diaminobutyric đều ko được phân giải rõ ràng với lysin với trong cái thử, lúc phân tách bằng sắc ký luận bàn ion. Vì thế, lúc sử dụng sắc ký bàn bạc ion để tách những acid amin, hàm lượng của asparagin và của glutamin mang mặt trong mẫu thử được xác định bằng hiệu số 7 giữa hàm lượng của acid aspactic và của acid glutamic tương ứng thu được lúc thủy phân acid ko với BTI và hàm lượng của acid aspartic và của acid glutamic tương ứng thu được lúc thủy phân có BTI. Hàm lượng của threonin, methionin, cystein, tyrosin và histidin mang thể bị sai lệch khi thủy phân bằng acid với BTI. Thành ra, muốn sở hữu trị giá đúng của những hàm lượng này, cái thử phải được thủy phân bằng acid, ko sở hữu thuốc thử BTI. Tách và phát hiện những acid amin mang phổ quát khoa học để tách và phát hiện các acid amin; lựa chọn công nghệ nào phụ thuộc vào yêu cầu về độ nhạy của phép định lượng. Nhìn chung, khoảng một nửa các phép Đánh giá acid amin dựa trên việc tách thành acid amin tự do bằng sắc lý lỏng bàn luận ion rồi tạo dẫn chất sau cột phân tích. Công nghệ tạo dẫn chất sau cột với thể ứng dụng cho các chiếc thử mang một l ượng nhỏ chất đệm (như các muối và urê) và thường cần trong khoảng 5 µg đến 10 µg dòng thử protein cho 1 lần Đánh giá. Những khoa học còn lại, bao gồm việc tạo các dẫn chất tr ước cột rồi tách chúng bằng sắc ký lỏng cao thế pha đảo. Các công nghệ tạo dẫn chất trước cột rất nhạy và thường chỉ cần trong khoảng 0,5 µg đến một,0 µg mẫu thử protein/peptid cho mỗi lần Phân tích, nhưng lại với thể bị tác động bởi các muối đệm với trong chiếc thử. Mặt khác, kỹ thuật tạo dẫn chất trước cột còn có thể cho rộng rãi dẫn chất khác nhau của cộng một acid amin, vì vậy gây trở lực cho việc biện giải kết quả Tìm hiểu. So có khoa học tạo dẫn chất trước cột, thường công nghệ tạo dẫn chất sau cột ít bị ảnh hưởng bởi các biến thiên trong việc thực hành phép định lượng hơn. Có thể dùng các khoa học sau đây để Phân tích định lượng các acid amin. Thiết bị và thuốc thử đều mang sẵn trên thị phần. Hơn nữa, hiện có nhiều cải tiến về các mặt như pha chế thuốc thử, bí quyết tiến hành phản ứng, trang bị sắc ký sử dụng trong các kỹ thuật này, v.v.... Các thông số đặc trưng mang thể thay đổi tùy thuộc vào đồ vật đã tiêu dùng và cách thức tiến hành Nhận định. Nhiều phòng thí nghệm còn vận dụng đồng thời phổ quát kỹ thuật chứ không chỉ một, để tận dụng ích lợi của mỗi khoa học đã ứng dụng. Trong những công nghệ sau đây, dấu hiệu như vậy được hiển thị trên máy ghi và diện tích các pic được tích phân để định lượng. Kỹ thuật 1: Tạo dẫn chất sau cột với thuốc thử ninhydrin Sắc ký bàn luận ion tạo dẫn chất sau cột với thuốc thử ninhydrin là 1 trong những kỹ thuật thông dụng nhất để Phân tích định lượng các acid amin. Theo nguyên tắc, sắc ký trao đổi cation, dùng lithi làm đối ion trong pha động được vận dụng để Tìm hiểu các cái thử sinh học phức tạp; ngược lại, sắc ký đàm đạo cation, tiêu dùng natri khiến đối ion trong pha động, nhanh hơn, được dùng với các cái thử đơn giản hơn, gồm hỗn tạp những acid amin đã được thủy phân trong khoảng protein/peptid ra (tiêu biểu gồm 17 acid amin khác nhau).
